每一位科研人員都希望自己做的實驗?zāi)艿玫揭粋€完美的結(jié)果，但是在操作過程中難免出現(xiàn)一些或大或小的問題。ELISA檢測可謂是免疫學(xué)反應(yīng)應(yīng)用到科研生產(chǎn)中廣泛靈敏的技術(shù)手段，但是也免不了出現(xiàn)花板，假陽性，全顯色，全部顯色，顯色比空白還低等等的問題。今天上海恒遠(yuǎn)為您總結(jié)7步ELISA檢測實驗經(jīng)驗，希望對ELISA新手們有所幫助。
1、包被原的性質(zhì)很重要，蛋白濃度，是否降解，這關(guān)系到你做出的抗體可不可以被其識別，所以保存抗原很重要，我做重組蛋白時，師兄都嚴(yán)格警告我一定要在冰浴下緩慢融化就是這個道理。還有有的包被原可能不是蛋白，對于生物素和脂類物質(zhì)或小分子物質(zhì)我們要事先對其改造再加以包被，方法簡要的列出如下:
①親和素生物素:先親和素先包被載體，加入生物素化的DNA，這種包被方法均勻、牢固，已擴(kuò)大應(yīng)用于各種抗原物質(zhì)的定量測定。
②脂類物質(zhì):可將其在有機(jī)溶劑(例如乙醇)中溶解后加入ELISA板孔中，開蓋置冰箱過夜或冷風(fēng)吹干，待酒精揮發(fā)后，讓脂質(zhì)自然干固在固相表面。
③小分子必須依靠和大的蛋白載體偶聯(lián)后才能固定在固相載體上。
2、包被液的選擇，一般選擇ph9.6的碳酸鹽緩沖液。但有時由于試驗的需要，包被原的特殊性也可能采用中性的緩沖溶液來包。應(yīng)注意以下原理：由于蛋白質(zhì)與聚苯乙烯固相載體是通過物理吸附結(jié)合的，靠的是蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)上的疏水基團(tuán)與固相載體表面的疏水基團(tuán)間的作用，這種物理吸附是非特異性的，受蛋白質(zhì)的分子量、等電點(diǎn)、濃度等的影響，大分子蛋白質(zhì)較小分子蛋白質(zhì)通常含有更多的疏水基團(tuán)，故更易吸附到固相載體表面。具體的試驗還要有堅固的理論外也要實踐，看一下終可不可以應(yīng)用到自己試驗當(dāng)中去。常用的包被液除了剛才提到的pH9.6碳酸鹽緩沖液，還有pH7.2的磷酸鹽緩沖液和pH7-8的Tris-HCL緩沖液等等。
3、封閉：繼包被之后用高濃度的無關(guān)蛋白質(zhì)溶液再包被的過程。封閉就是讓大量不相關(guān)的蛋白質(zhì)充填這些空隙，從而排斥ELISA后的步驟中干擾物質(zhì)的再吸附。常用封閉劑有：0.05%-0.5%的BSA;10%的小牛血清或1%明膠;脫脂奶粉，比較價廉，可以高濃度使用(5%-10%);還有一些稀有用到的各種動物血清(主要為了排除相似蛋白干擾)和酪蛋白等等。但終選用什么，要依據(jù)試驗具體來實踐。
4、洗滌板：可以說在ELISA操作中，洗滌是主要的關(guān)鍵技術(shù)。因為聚苯乙烯等塑料對蛋白質(zhì)的吸附是普遍性的，為達(dá)到分離游離的和結(jié)合的酶標(biāo)記物的目的，清除殘留在板孔中游離的物質(zhì)，以及非特異性地吸附的干擾物質(zhì)，在洗滌時又應(yīng)把這種非特異性吸附的干擾物質(zhì)洗滌下來。所以在洗板時會有一定誤差，人為因素很大(當(dāng)然有條件的用洗板機(jī)除外)，洗的不*或串了孔，對如此靈敏的ELISA系統(tǒng)可是不小的影響。
5、加抗體標(biāo)本(和二抗):注意該換槍頭時換槍頭。標(biāo)本稀釋一般可用PBS稀釋，也可用封閉液去稀釋。如需加二抗，還要注意二抗的工作濃度，太高浪費(fèi)，太低則著色淺。
6、顯色：顯色系統(tǒng)又很多，我們一開始做的時候，要選擇適宜的顯色系統(tǒng)。注意顯色系統(tǒng)酶活性底物的保存HRP結(jié)合物加硫柳泵，AP結(jié)合物可加疊氮鈉。
7、每次做盡量要把陰陽空三個對照做好，如出現(xiàn)問題也好分析。
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