免疫熒光標(biāo)記樣品

用于流式細(xì)胞 儀檢測(cè)的常用熒光素有FITC、TRITC、Cy3、Cy5，PE和PI，在以上各種熒光染料中，PE熒光zui強(qiáng)，適用于弱表達(dá)抗原；FITC*，適用于強(qiáng)表達(dá)抗原，適用范圍廣。

1．直接免疫熒光標(biāo)記法

取一定量的細(xì)胞懸液（濃度約1×10⁶ 個(gè)/ml），直接加入熒光素標(biāo)記抗體進(jìn)行免疫反應(yīng)（如做雙重標(biāo)記或多重標(biāo)記染色，可把幾種標(biāo)記有不同熒光素的抗體同時(shí)加入）。4℃孵育15～30分鐘后，用1/15mol/LPBS（pH 7.2～7.4）洗1～2次，加入緩沖液重懸，上機(jī)檢測(cè)。

本方法操作簡(jiǎn)便，結(jié)果準(zhǔn)確，易于分析，適用于同一細(xì)胞群多參數(shù)同時(shí)測(cè)定。雖然直接熒光抗體標(biāo)記試劑成本較高。但減少了間接標(biāo)記法中較強(qiáng)的非特異熒光干擾，因此更適用于臨床標(biāo)本的檢測(cè)。

2．間接免疫熒光標(biāo)記法

取一定量的細(xì)胞懸液（濃度約5×10⁶ 個(gè)/ml），加入特異性*抗體，4℃孵育15～30分鐘，待反應(yīng)*后用磷酸緩沖液洗去未結(jié)合抗體，吸盡殘留液體，再加入熒光標(biāo)記第二抗體，4~C孵育30分鐘，抗原―抗體―抗抗體復(fù)合物，洗滌后即可上機(jī)檢測(cè)。注意：在整個(gè)熒光標(biāo)記過(guò)程中均需參考免疫熒光細(xì)胞化學(xué)間接法染色程序，尤其是加入一抗前需使用正常非免疫血清封閉，以減少非特異性反應(yīng)。如果對(duì)于未經(jīng)固定的細(xì)胞需使用0.3%TritonX-100為細(xì)胞膜打孔，以保證抗體能夠進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。

此法費(fèi)用較低，二抗應(yīng)用廣泛，多用于科研樣品檢測(cè)。但是，由于非特異性熒光背景較強(qiáng)，

影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果，在樣品制備時(shí)應(yīng)加人陰性或陽(yáng)性對(duì)照。另外，由于間接法步驟較多，尤其是經(jīng)過(guò)多次洗滌，均可使細(xì)胞數(shù)量驟減，因此，在加入*抗體前細(xì)胞懸液的細(xì)胞濃度約5×10⁶個(gè)/ml，上機(jī)檢測(cè)前不少于1×10⁶ 個(gè)/ml即可，此法不適用測(cè)定細(xì)胞數(shù)較少的樣品。

3．熒光標(biāo)記中的注意事項(xiàng)

① 為減少非特異性干擾，熒光標(biāo)記物用前應(yīng)用0．22um濾膜過(guò)濾或高速離心5分鐘，以除去顆粒或沉渣。

② 細(xì)胞樣品的制備、染色及保存均應(yīng)該盡量保持新鮮，防止分解代謝引起的表面抗原消失及細(xì)胞死亡，可以通過(guò)加入營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基或低濃度血清以及4~0或冰浴中操作來(lái)解決。

③ 細(xì)胞或低比例細(xì)胞亞群分析時(shí)，為保證準(zhǔn)確，應(yīng)排除死細(xì)胞。

④ 熒光標(biāo)記抗體濃度應(yīng)該合適，如果濃度過(guò)高，會(huì)使非特異性結(jié)合增加。在使用一抗之前，將樣品與過(guò)量的牛血清白蛋白（BSA）或來(lái)源于同一種屬的正常血清一起孵育，以阻斷一抗和細(xì)胞表面或胞內(nèi)結(jié)構(gòu)非特異性作用。在使用一抗之后，將樣品、與二抗相同種屬的5%～10%正常血清和二抗一起孵育，以減少二抗與一抗、細(xì)胞表面或胞內(nèi)結(jié)構(gòu)之間的非特異相互作用。如果使用含有與一抗或二抗種屬相同的血清液體稀釋抗體，便可以省略此步驟。