糖基轉(zhuǎn)移酶活性分析

R&D Systems現(xiàn)已開發(fā)出一種多功能的非放射性檢測(cè)方法，能測(cè)定糖基轉(zhuǎn)移酶活性。分析使用了一種特定的磷酸酶，它釋放糖基轉(zhuǎn)移酶反應(yīng)過程中產(chǎn)生的核苷酸上的磷酸。隨后利用孔雀石綠磷酸鹽檢測(cè)試劑來評(píng)估磷酸鹽水平。因?yàn)獒尫诺牧姿猁}濃度與轉(zhuǎn)移的糖分子量成正比，所以可測(cè)定糖基轉(zhuǎn)移酶的動(dòng)力學(xué)參數(shù)。此外，這種顯色分析在96孔板中開展，適合高通量研究

　糖基轉(zhuǎn)移酶是催化單糖基團(tuán)從糖基供體向受體底物轉(zhuǎn)移的酶。其中大部分被歸為Leloir酶，它們利用核苷酸糖作為供體，并在反應(yīng)中核苷酸磷酸鹽。分析糖基轉(zhuǎn)移酶活性相當(dāng)具有挑戰(zhàn)性。zui常用的方法是檢測(cè)放射性標(biāo)記的糖從供體轉(zhuǎn)移到受體分子。各種非放射性的檢測(cè)方法也被不斷開發(fā)；然而，它們中的大部分是為特定糖基轉(zhuǎn)移酶定制的。

為了證明這種技術(shù)的實(shí)用性，我們?cè)u(píng)估了Clostridium difficile毒素B（TcdB；圖2A）、人O-糖基轉(zhuǎn)移酶I（KC1；圖2B）和人ST6GAL1（圖2C）的酶活。TcdB和KC1是具有UDP-葡萄糖水解酶活性的糖基轉(zhuǎn)移酶，它們?cè)诜磻?yīng)中副產(chǎn)物UDP。磷酸酶CD39L3水解核苷酸β-磷酸鹽，并從UDP上釋放出游離的磷酸鹽。相比之下，ST6GAL1是唾液酸轉(zhuǎn)移酶，它催化了N聚糖中唾液酸從α2,6轉(zhuǎn)移到β 1-4GlcNAc結(jié)構(gòu)。對(duì)于此反應(yīng)，CMP-NeuAc充當(dāng)供體底物，而N-乙酰乳糖胺（LN）則充當(dāng)受體。利用5’核苷酸酶CD73從反應(yīng)中產(chǎn)生的CMP上釋放出游離的磷酸鹽。對(duì)于這三種糖基轉(zhuǎn)移酶的反應(yīng)，利用孔雀石綠檢測(cè)試劑測(cè)定游離磷酸鹽水平，以獲得相對(duì)供體底物濃度的特定活性（pmol/min/µg）的準(zhǔn)確測(cè)定（圖2）。