一細胞的裂解
單層細胞的裂解
懸浮培養的細胞或組織單細胞懸液的裂解
a．單層細胞的裂解
a）吸出培養液，以7ml用冰預冷的無鈣鎂離子磷酸緩沖鹽溶液PBS沖洗細胞培養皿內的單層細胞，重復1次，將平板置于冰上直至所有單層細胞沖洗完畢。也可將平板放在一塊鋁板上，再將鋁板置于冰盤上。
b）直徑為90mm的培養皿需加0.5ml RNA提取緩沖液， 并使之遍布整個平板的表面。
RNA提取緩沖注液
0.14mol/L NaCl
1.5mmol/L MgCl2
10mmol/L Tris.Cl（pH8.6）
0.5％NP-40
1mmol/L二硫蘇糖醇（DTT）
100單位/ml胎盤RNA酶抑制劑或20mmol/L氧釩核糖核苷復合物
c）加0.5ml蛋白酶消化緩沖液，用刮棒混勻粘稠狀裂解物并將其刮到平板的邊緣。
蛋白酶消化緩沖液
0.2mol/L Tris.Cl（pH8.0）
25mmol/L EDTA（pH8.0）
0.3mol/L NaCl
2％ SDS
d）用裝有21號針頭的皮下注射器抽吸細胞裂解物，再將其注入聚丙烯管內。重復3－4次，剪切DNA。
c）加蛋白酶K至終濃度為200μg/ml，充分混勻后置于37℃溫育30分鐘。
蛋白酶K以貯存液的形式保存，貯存液為20mg/ml 蛋白K溶液。
b．懸浮培養的細胞或組織單細胞懸液的裂解
a）于4℃以2000g離心5分鐘收集細胞，以10倍體積用冰預冷的無鈣鎂離子磷酸緩沖液懸沉淀，洗滌細胞3次，每次均用大口徑的吸管輕輕吹打細胞沉淀，使其*分散。
b）估計細胞沉淀的體積，用10-20倍體積的RNA提取緩沖液重懸之。
c）加入與步驟b）所加RNA提取緩沖液體相同的蛋白酶消化緩沖液，用振蕩器迅速混勻。用裝有21號針頭的皮下注射器抽吸細胞裂解物，再將其注入聚丙烯管內。重復3－4次，剪切DNA。
d）加蛋白酶K至終濃度為200μg/ml，充分混勻后置于37℃溫育30分鐘。蛋白酶K以貯存的形式保存，貯存液為20μg/ml蛋白酶K水溶液。
二提取步驟
1）用等體積酚：氯仿抽提1次，以去除蛋白質。
2）用吊桶式轉頭于室溫以5000g離心10分鐘使水相與有機相分相， 將水相吸至一個新的離心管內，加2.5倍體積用冰預次序的乙醇，充分混勻， 于0℃放置1小時。
3）于0℃以5000g離心10分鐘沉淀RNA，棄上清，用含0.1mol/L 乙酸鈉（pH5.2）的70％乙酸洗滌沉淀，用自動微量移液器盡可能將乙醇吸盡， 隨后于室溫放置幾分鐘，晾干沉淀。切勿抽干沉淀，因為干的核酸沉淀很難溶解。
4）每個直徑為90mm的培養皿或每107細胞加200μl 50mmol/L Tris.Cl（ pH7.8）1mmol/L EDTA（pH8.0）溶液重溶沉淀。
5）分別按10mmol/L和0.1mmol/L的深度加MgCl2和二硫蘇糖醇（DTT），然后分別按1000單位/或10mmol/L 的終深度加臺盤RNA酶抑制劑或氧釩核苷復合物。
6）加入無RNA酶的胰DNA酶I至終濃度為2μg/ml，混勻，于37℃溫育60分鐘。
7）分別按10mmol/L和0.2％的終濃度加EDTA和SDS。
8）用等體積酚：氯仿抽提1次。
9）于室溫以5000g離心10分鐘使水相與有機相分相， 將水相吸至另一個離心管內，加3mol/L乙酸鈉（pH5.2）至終濃度為0.3mol/L，加2.5倍體積用冰預次的乙醇，充分混勻，冰浴放置2小時。
10）用微量離心機于4℃以12 000g離心5分鐘沉淀RNA。
11）吸出所有的乙醇，將打開管蓋的離心管在實驗臺放置幾分鐘，讓zui后殘存的痕量乙醇揮發干凈。
12）用200μl TE（pH7.6）重溶沉淀，加500μl乙醇，于－70 ℃貯存備用。回收DNA時，只須取出1小份貯存液，加入3mol/L乙酸鈉（pH5.2 ）至終濃度為0.3mol/L，充分混勻，用微量離心機于4℃以12 000g離心5分鐘即可。
三注意事項
1．測定zui終所得溶液的OD260值可以確定RNA的濃度。取10μl乙醇/TE混合液[步驟13）]離心沉淀RNA，以400水重溶， 測定OD260 值， OD260＝1的RNA溶液每毫升約含40μg RNA。
2.如果需要，可用oligo（dT） －纖維素層析法從所制備的細胞總RNA中純化無寡脫氧核糖核苷酸污染的mRNA或購買試劑盒進行mRNA的純化。
3.某些情況下（例如從感染了DNA病毒或用DNA轉染的細胞中制備RNA時），必須從細胞總RNA中去除寡脫氧核核苷酸。否則，當用這種RNA構建cDNA庫或進行引物延伸反應時應會出問題， 反轉錄過程中法染的模板DNA 片段可能會與RNA雜交而充當引物，從而導致物定mRNA5'末端定位的錯誤或產生截短的cDNA克隆。
a）步驟12后，加200μl 3mol/L乙酸鈉（pH5.2），用自動微量移液器反復吹吸，以重懸核酸沉淀，將懸浮液移至另一個滅菌的微量離心管內。
b）用微量離心機于室溫以12 000g離心10分鐘，RNA沉于管底，而絕大部分寡脫氧核糖核苷酸仍在上清中。
c）棄上清液，用200μl TE（pH7.6）重溶沉淀。加入20μl 3mol/L乙酸鈉（pH5.2），分混勻，加入550μl用冰預冷的乙醇。混勻溶液， 在冰上驟冷30分鐘。用微量離心機于4℃以12 000g離主10分鐘，以回收RNA。小心吸出上清。d）棄上清液，用300μl TE（pH7.6）重溶沉淀，加1ml乙醇，－70℃貯存備用。
回收RNA時，只需取出1小份貯存液，加3mol乙酸鈉（pH5.2 ）至終濃度為0.3mol/L充分混勻，用微量離心機于4℃以12 000g離心5分鐘即可。如需去除氧釩核糖核苷復合物，用含0.1％羥喹啉的苯酚[用0.01mol/L Tris.Cl（pH7.8）平衡]將RNA終溶液抽提數次即可。
4. 對大多數細胞株來說， 一個直徑90mm 培養甲中培養的RNA收率為100-200μg
上海恒遠ELISA試劑盒供應商是一家專業代理國外生命科學基礎研究以及臨床檢測等諸多領域的試劑、耗材、儀器的企業。產品涉及分子生物學、免疫學、生命科學基礎研究以及臨床檢測等諸多領域，同時我們提供專業的生物技術服務。
公司主營產品：ELISA試劑盒、人ELISA試劑盒、大鼠ELISA試劑盒、小鼠ELISA試劑盒、生物試劑、進口抗體、微生物培養基、標準品等。
為了中國生命科學事業的騰飛，我們全力以赴！
咨詢電話