檢測范圍
2nmol/L - 50nmol/L
使用目的
本試劑盒用于測定人血清，血漿及相關(guān)液體樣本中25羥基維生素D（25(OH)D）含量。
實驗原理
本試劑盒應(yīng)用雙抗體夾心法測定標本中人25羥基維生素D（25(OH)D）水平。用純化的人25羥基維生素D（25(OH)D）抗體包被微孔板，制成固相抗體，往包被單抗的微孔中依次加入25羥基維生素D（25(OH)D），再與HRP標記的25羥基維生素D（25(OH)D）抗體結(jié)合，形成抗體-抗原-酶標抗體復(fù)合物，經(jīng)過徹-底洗滌后加底物TMB顯色。TMB在HRP酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的25羥基維生素D（25(OH)D）呈正相關(guān)。用酶標儀在450nm波長下測定吸光度（OD值），通過標準曲線計算樣品中人25羥基維生素D（25(OH)D）濃度。
標本要求
1．標本采集后盡早進行提取，提取按相關(guān)文獻進行，提取后應(yīng)盡快進行實驗。若不能馬上進行試驗，可將標本放于-20℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融
2．不能檢測含NaN3的樣品，因NaN3抑制辣根過氧化物酶的（HRP）活性。
操作步驟
1. 標準品的稀釋：本試劑盒提供原倍標準品一支，用戶可按照下列圖表在小試管中進行稀釋。
48nmol/L | 5號標準品 | 150μl的原倍標準品加入150μl標準品稀釋液 |
24nmol/L | 4號標準品 | 150μl的5號標準品加入150μl標準品稀釋液 |
12nmol/L | 3號標準品 | 150μl的4號標準品加入150μl標準品稀釋液 |
6nmol/L | 2號標準品 | 150μl的3號標準品加入150μl標準品稀釋液 |
3nmol/L | 1號標準品 | 150μl的2號標準品加入150μl標準品稀釋液 |
2. 加樣：分別設(shè)空白孔（空白對照孔不加樣品及酶標試劑，其余各步操作相同）、標準孔、待測樣品孔。在酶標包被板上標準品準確加樣50μl，待測樣品孔中先加樣品稀釋液40μl，然后再加待測樣品10μl（樣品最終稀釋度為5倍）。加樣將樣品加于酶標板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻。
3. 溫育：用封板膜封板后置37℃溫育30分鐘。
4. 配液：將30倍濃縮洗滌液用蒸餾水30倍稀釋后備用
5. 洗滌：小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30秒后棄去，如此重復(fù)5次，拍干。
6. 加酶：每孔加入酶標試劑50μl，空白孔除外。
7. 溫育：操作同3。
8. 洗滌：操作同5。
9. 顯色：每孔先加入顯色劑A50μl，再加入顯色劑B50μl，輕輕震蕩混勻，37℃避光顯色10分鐘.
10. 終止：每孔加終止液50μl，終止反應(yīng)（此時藍色立轉(zhuǎn)黃色）。
11. 測定：以空白孔調(diào)零，450nm波長依序測量各孔的吸光度（OD值）。 測定應(yīng)在加終止液后15分鐘以內(nèi)進行。
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